Akademik Veri Yönetim Sistemi
Kurt Kızıldoğan A. (Yürütücü)
TÜBİTAK Projesi, 2014 - 2015
Nükleozit tipi antibiyotikler özgün biyolojik aktiviteleri ve kompleks kimyasal yapıları dolayısıyla bilhassa ilaç endüstrisinin
önemli bir parçasıdırlar (Ichikawa, 2006). Bir nükleozit antibiyotiği olan tunikamisin yapısal olarak diğer antibiyotiklerden
oldukça farklı olup urasil, N-asetilglukozamin (GlcNAc), tunikamin adı verilen 11 karbonlu aminoaldoz seker ve faklı uzunlukta
N-açil yan zircirlerden meydana gelmektedir (Price ve Tsenatova, 2007). İlk defa 1971 yılında Streptomyces lysosuperificus’ (S.
lysosuperificus) dan izole edilmis ve benzer bilesiklerin farklı mikroorganizmalar tarafından üretildiği daha sonraki yıllarda
ortaya çıkmıstır; streptovirudin (Eckardt ve ark., 1975), korinetoksin (Thrum ve ark., 1975), MM19290 (Kein ve Reading, 1979),
mikosposidin (Vogel ve ark., 1981). Bunlardan MM19290; Streptomyces clavuligerus (S. clavuligerus) tarafınan üretilmekte
olup tunikamisinin diğer türevlerinde olduğu gibi çekirdek kısmı aynıve fakat yağ asitlerinden olusan yan zinciri kısmında
farklılık göstermektedir (Wysznsky ve ark., 2010). Bu antibiyotik; tunika adı verilen viral kılıfı inhibe ederek antiviral aktivitesini
göstermesinden dolayı tunikamisin olarak adlandırılmıstır (Takatsuki ve ark., 1971). Tunikamisin bakteri hücre duvarı sentezinin
peptidoglikan öncülü lipit I’ in olusumunu hedef aldığı bilinen ilk nükleozit tipi antibiyotik olup aynı zamanda ökaryotlarda erken
ara ürün olan dolisilpirofosforil-N-asetilglukozaminin olusumunu bloke eden protein N-glikolizasyon inhibitörleri olarak yaygın
kullanıma sahiptirler (Wysznsky ve ark., 2010). Bu özelliklerinden dolayı (protein glikolizasyonunu ve bakteri peptidoglikan
biyosentezini inhibe etmesi bakımından) oldukça önemli bir antibiyotiktir. Tunikamisin gram pozitif bakteri, fungus ve virüsler
üzerinde etkindir (Takatsuki ve ark., 1971). Bunun yanı sıra, tunikamisinin antikanser ilaçları ile birlikte kullanımının ilacın
dirençli tümör hücreleri üzerinde etkinliğini artırdığı gösterilmistir (Noda, 1999; Shiraishi, 2005; Hiss, 2007). Yine, tunikamisinin
diyabet gibi T hücre aracılı otoimmün hastalıkları için tedavi fırsatları sunabilmektedir (Shaabani ve ark., 2012). Ancak bu
antibiyotiğin biyosentez basamakları ve sorumlu genlerle ilgili çalısmalar oldukça yenidir. Özellikle klonlama ve karakterizasyon
çalısmaları hem tunikamisin biyosentez yolağı hem de daha etkin ve seçici özellikli yeni tunikamisin analoglarının
kombinatoryal biyosentezi için temel olusturmaktadır (Chen ve ark., 2010). Yüksek islem hacimli heterolog ekspresyon
stratejisi, genom madenciliği gibi çesitli biyoinformatik yöntemlerle minimal tunikamisin gen kümesi tespit edilmistir. Bu gen
kümesi, 12 kb büyüklüğünde ve toplamda 14 ORF (tunA-N) (biyosentetik, self-resistans ve transporttan sorumlu genler) den
olusmaktadır (Wyszynski ve ark., 2010). Önerilen tunikamisin gen kümesinde regülatör bir genin olmayısı tunikamisin
üretiminin gelisimle alakalı global kontrol altında olduğunu ve ayrıca Streptomyces genomunda nadir görülen TTA lösin
kodonunun tunA ve tunM genlerinde var olusu translasyonel düzenlenmeden sorumlu bir elementin kontrolünde olabilirliğini
isaret etmektedir. Bu nedenle, bu çalısmada β-laktam antibiyotiği sefamisin C ve β-laktamaz inhibitörü klavulanik asiti üreten ve
ayrıca tunikamisin gen kümesinin belirlenmesinde genomu kalıp olarak kullanılan S. clavuligerus’ta 1) Pleiotropik regülatör
kodlayan bldG geninin blokasyonu ile elde edilecek S. clavuligerus bldG::aac(3)IV-oriT mutantında, 2) Sefamisin C, klavulanik
asit ve holomisin üretimi üzerinde etki gösteren yolak özgü ccaR regülatör geninin yokluğunda (S. clavuligerus ccaR::aph) ve
ccaR geninin çoklu ifadesi durumunda (S. clavuligerus AK23) tunikamisin biyosentetik gen kümesini olusturan herbir genin
ifadesinde ve tunikamisin biyosentezinde meydana gelecek muhtemel değisiklikler incelenecek, 2) ve böylelikle tunikamisin
biyosentez yolunda hangi regülasyon mekanizmalarının etkin olduğu belirlenmeye çalısılacaktır. Gen ifadelerini incelemek için
kantitatif PCR (qRT-PCR) tekniği, tunikamisin biyosentezini belirlemek için ise biyoassay ve HPLC yöntemleri kullanılacaktır.
Elde edilecek bulgular ısığında, CcaR regülatör proteininin tunikamisin gen kümesindeki muhtemel bağlanma bölgeleri EMSA
ile belirlenecektir. Elde edilecek bulgular, tunikamisin biyosentezinin hangi faktörler tarafından kontrol edildiği ile ilgili olan bilgi
eksikliğinin tamamlanmasını ve yolağın iyi anlasılmasıyla yeni ve daha verimli tunikamisin analoglarının dizaynına katkı
sağlayacaktır.