Akademik Veri Yönetim Sistemi
Kurt Kızıldoğan A. (Yürütücü), Okay S.
TÜBİTAK Projesi, 2015 - 2018
Önerilen proje kapsamında ilaç endüstrisinde önemli bir role sahip antibiyotik üreticisi bir mikroorganizma olan Streptomyces clavuligerus’ta demir regülasyonu ve antibiyotik üretimi arasındaki bağlantının ortaya çıkarılması yoluyla antibiyotik üretimi mühendisliği bakımından hedef düzenleyicilerin belirlenmesi ve aynı zamanda bu bakteride demir kullanımı ile ilgili olan moleküler mekanizmanın ortaya çıkarılması amaçlanmaktadır.
Demir canlıların yaşamsal faaliyetlerini sürdürebilmeleri için gerekli yapısal bir elementtir. Özellikle mikroorganizmalar yaşadıkları ortamdaki düşük konsantrasyonlu ferrik iyonunu kullanabilmek için siderofor adı verilen küçük molekül ağırlıklı bileşikler üretmektedirler. Patojenler ve antibiyotik üreticisi bakterilerin siderofor ürettikleri bilinmektedir. Dünyada mevcut antibiyotiklerin üçte ikisini üreten ve 25 milyar dolarlık piyasa hacmine sahip Streptomyces cinsinde sideroforlar sporlanma, antibiyotik veya diğer sekonder metabolitlerin üretiminde önemli bir role sahiptir (Yamanaka vd., 2005). Birçok Streptomyces türünde siderofor biyosentezinde, sideroforların hücre dışına salınımı ve demir-siderofor komplekslerinin hücre içine alınımından sorumlu genler ve gen kümeleri belirlenmiş ve ayrıca demir metabolizması ve antibiyotik üretimi/morfogenez arasındaki bağlantıyı gösteren birçok çalışma yapılmıştır. Ancak, bir b-laktam antibiyotiği olan sefamisin C, antitümör ajanları holomisin, tunikamisin-türevi (MM19290) antibiyotiklerle klavulanik asit gibi önemli bir ilaç hammaddesini üretebilen S. clavuligerus’un siderofor gen kümesi ve demir regülasyonunun ürettiği bu sekonder metabolitlerle olan ilişkisi henüz açıklanmamıştır. β-laktamların pazar hacminin 10 milyar dolar olduğu dikkate alındığında endüstriyel anlamda antibiyotik üretiminde artış sağlanabilmesi için planlanan yaklaşım oldukça umut verici sonuçlar verme potansiyelindedir. Genomu 2010 yayınlanan S. clavuligerus' ta ilk defa siderofor gen kümesi, ilgili genlerin transkripsiyonel regülasyonu, ve düzenleyici proteinlerin siderofor ve antibiyotik biyosentezleri üzerine olan etkileri bu proje önerisi kapsamında araştırılacaktır.
Proje kapsamında yapılan ön çalışmalarla NCBI sayfasında S. clavuligerus genomuna ait nükleotit dizileri taranmış ve başka Streptomyces türlerinde atıflandırılmış potansiyel siderofor biyosentez kümesi, siderofor transportunda rol alan genler ve siderofor biyosentezi üzerinde etki göstermesi muhtemel regülatör proteinlere ait benzer gen dizileri belirlenmiştir. BLAST programı ile diğer Streptomyces'lerdeki gen/proteinlere olan % özdeşlikleri tespit edilmiştir. Bu çalışmalar sonucunda genetik çalışmalarda özellikle Streptomyces için model organizma olan S. coelicolor' daki siderofor biyosentez kümesine benzer bir küme bulunmuştur. Regülatör gen olarak Dtx-ailesi transkripsiyonel regülatörü ve DesR benzeri demir repressörünü kodladığı ifade edilen SCLAV 3415 ve Fur ailesine benzer demir alımı regülatör proteinini kodlayan SSCG_01120 genleri hedef olarak seçilmiştir. Bu projede ilk kez ilgili regülatör genler S. clavuligerus kromozomunda REDIRECT yöntemi ile bloke edilecek ve mutant bakteri ile yabanıl suş demir içeren ve içermeyen sentetik besiyerinde üretilerek, elde edilen RNA lardan RNA transkriptom analizi gerçekleştirilecek, gen ifadelerindeki değişimler incelenecektir. Ayrıca, bu koşullarda Tablo Ek1 ve Ek2 de listelenen genlerin ifadeleri qRT-PCR ile analiz edilecek, S. clavuligerus tarafından sentezlenen siderofor, sefamisin C, klavulanik asit, holomisin ve tunikamisin türevi sekonder metanolit üretimleri gerek biyoassay, gerek HPLC ile mutant bakteriye kıyasla karşılaştırmalı olarak incelenecektir. Son olarak ise transkriptom analizleri ve de qRT-PCR sonuçlarından yola çıkılarak belirlenmiş/belirlenecek genlerin promotorlarında, seçilen regülatör genlerin bağlanma bölgelerinin olup olmadığı EMSA deneyleri ile araştırılacaktır.
Mikroorganizmalar tarafından üretilen doğal antibiyotiklerin keşfi ve mevcut olanların geliştirilmesi farmastötik endüstrisi açısından oldukça önemlidir. Doğal ürünlere dayalı terapötik maddelerin geliştirilmesinde, ilgili bileşiklerin biyosentetik potansiyellerinin anlaşılması bu ürünlerin biyosentez mekanizmalarının iyi bir şekilde açıklanmasıyla mümkündür. Bu bağlamda, elde edilecek sonuçlar siderofor biyosentezinin regülasyonu, siderofor biyosentezi ve antibiyotik (sekonder metabolit) üretimi arasındaki ilişkiyi aydınlatacak bulgular verecek olması bakımından hem temel bilimlere katkı sağlayacak hem de biyoteknolojik ve endüstriyel açıdan önemli bir bakteri olan S. clavuligerus' ta antibiyotik üretiminin artırılmasına yönelik yeni hedefler bulma şansını doğurma potansiyeli sunacaktır.